去糖牛奶的制備方法
一種從牛奶或乳清水中提取高純度蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種從牛奶或乳清水中提取高純度蛋白的方法 背景技術(shù)
本發(fā)明涉及一種用攪拌罐同時從牛奶或乳清水中提取高純度的乳鐵蛋白
(bovine lactoferrin, 縮寫為BLF)、氧化酶蛋白(bovine lactoperoxidase， 縮寫為BLP)以及乳鐵蛋白和氧化酶蛋白混合物的方法。氧化酶蛋白和乳鐵蛋白 有著廣譜的抗菌，抗病毒及提高機體抗病的免疫功能。例如BLP能夠破壞病菌的 細胞質(zhì)，抑制病菌生長過程中的核糖核酸的合成。因而其對革蘭氏陽性菌及革 蘭氏陰性菌，酵母如白色念珠菌，以及霉菌如黑曲霉菌都有抑制作用。哺乳類 動物中的分泌物中存在氧化酶蛋白，特別是乳汁中。但其濃度在初乳中很低， 4-5天后其濃度迅速增加作為母體傳給初生兒的抗菌素。因為初生兒的免疫糸統(tǒng)
尚未發(fā)育健全，需要從母乳中得到保護以抵抗入侵的病菌及病毒。
牛乳鐵蛋白（BLF)是一個含鐵的糖蛋白，與氧化酶蛋白相反，其在初乳的濃 度很高，幾天后其濃度就迅速下降。BLF也是一個很廣譜的抗菌蛋白。它可以將 鐵離子從病菌中搶過來，從而使病菌失鐵受抑制或死亡。所以BLF對革蘭氏陽性 菌如金黃色葡萄球菌，鏈球菌等；革蘭氏陰性菌如大腸桿菌，痢疾桿茵，及志 賀氏桿菌；幽門螺旋桿菌，流感病毒，濕麥病毒及涎腺病毒都有抑制作用。
由于單純的BLP及BLF都具有生物抗菌蛋白的功能，它們兩種一起的混合物 也應具有抗菌，抗病毒及提高機體免疫力的功能。
已有報導的已實驗室規(guī)模分離出BLF,如用DEAE, S印hadexC50, CMSephaseFF, CMToyopear 1 ， BioradMacro-preCM， Dowx-mac-3以及Pur i 1 i teC115 離子交換樹脂。但這些方法是將樹脂裝柱使用并且采用緩沖液。這樣的方法是 不適用大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)實踐。由于BLF及BLP在牛奶中的濃度很低，要生產(chǎn)出 有商業(yè)經(jīng)濟價值的，高純度的BLP與BLF必須要釆用極大量的牛奶以提供足夠的 BLF和BLP,比如說要日產(chǎn)20公斤純度為96y。以上BLF，假設(shè)其總收率為80°/。，原料 牛奶中的BLF是180mg/L。這就需要160噸牛奶。而且這160咱牛奶的處理時間必 須要在10小時內(nèi)完成，因為要考慮到過長的加工時間不但會增加牛奶染菌的機 會，而且要留出時間給離子交換樹脂柱再生及衛(wèi)生消毒以準備第二天的工作。 再者由于牛奶中離子強度約為6-7mS(毫西門），導致BLF與BLP的吸附動力學很 慢，約需50分鐘才能達到總量的60。/。以上。因此必須要給予樹脂和牛奶有足夠的 接觸時間。同時為了使牛奶中盡可能多的BLP， BLF與樹脂交換官能團接觸生產(chǎn) 交換反應，必須耍保證一定牛奶流動的線速度，這就是說，柱中線速度越大，
其樹脂吸咐動力學就越快。比如說柱中的線速度至少要在100cm每小時以上 (1.6cm每分鐘），對一個直徑為50cm的園柱來說，要達到l. 6cm每分鐘的線速度， 其體積流量就至少要在3. 2升每分鐘。如果接觸時間不少于50分鐘的話，柱的長 度要在83cm以上。但是當柱的直徑超過30cm時其柱長度超過50cm的話，就很難 保證其流量及裝柱的質(zhì)量。因而上述這些離子交換樹脂是為實驗室規(guī)模設(shè)計， 都不具備在工業(yè)規(guī)模條件下仍保持高流量的性能，因此無法應用于如此規(guī)模的 生產(chǎn)過程。再者如果在解咐的過程中釆用緩沖液，還大大的增加生產(chǎn)成本，使 產(chǎn)品無法竟爭，這更是工業(yè)生產(chǎn)上不可取的。
也有報導釆用超濾膜來從乳清中分離BLF，但此法生產(chǎn)出的BLF的純度很低， 只有約30%左右。其中的一個可能的因素就是BLP和BLF的分子量很相近，現(xiàn)階段
的超濾膜技術(shù)是不可能將這兩種蛋白分開。
有報導用等電沉淀法來提取BLF，但由于BLF與BLP的等電點很相近，此法無
法生產(chǎn)出高純度的BLP及BLF。
有報導使用肝素瓊脂親和色譜來提取BLF，但此法的生產(chǎn)成本太高，無法實
現(xiàn)工業(yè)規(guī)模。 發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有從牛奶或乳清水中提取高純度蛋白技術(shù)不能低成本進行大工業(yè) 生產(chǎn)的問題。本發(fā)明提供一種用攪拌罐同時從牛奶或乳清水中提取高純度的乳 鐵蛋白、氧化酶蛋白以及乳鐵蛋白和氧化酶蛋白混合物的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種從牛奶或乳清水中提取高純度蛋白的方法，它采用放置陽離子交換樹 脂的攪拌罐來吸附、解附、分離提取牛奶或乳清液中的乳鐵蛋白、乳氧化酶蛋 白及其兩者混合物，并輔以膜分離技術(shù)將其分離濃縮和高度純化。
攪拌罐可調(diào)攪拌漿轉(zhuǎn)速為20—100rpm;罐內(nèi)側(cè)壁有增渦流擋板，罐底設(shè)置 帶過濾板的樹脂床，在樹脂床上的樹脂層上方8-12cm高度處設(shè)置快速導流抽濾 管。罐內(nèi)設(shè)置供自動控制的各種傳感器pH計，重量計，導電率計及溫度計，罐內(nèi) 液體保溫溫度為3-16 0°C。樹脂為SPC70樹脂，樹脂吸附解附的次數(shù)和條件可 以根據(jù)不同產(chǎn)品和產(chǎn)品純度的要求設(shè)定；樹脂的吸附時間為20—180分鐘，吸附 溫度在3-3(TC。樹脂的吸附時間為35—60分鐘。樹脂的解附釆用兩級鹽濃度解 附乳鐵蛋白、乳氧化酶蛋白。第一級鹽濃度為1一2.5%，解附乳氧化酶蛋白，解 附時間為30-100分鐘；第二級鹽濃度為3. 5—7%,解附乳鐵蛋白，解附時間為 30-100分鐘；解附乳氧化酶蛋白及乳鐵蛋白混合物的鹽濃度為3-7%解附時間為 30—IOO分鐘；解附的攪拌速率為20-100rpm。樹脂解附所用的鹽是鈉鹽、鈣鹽， 鉀鹽；樹脂在經(jīng)吸附和解附工藝過程后，無需再生活化，只要在解附工藝結(jié)東 后用反滲透水（RO水）漂洗樹脂至其離子強度低于l. 6ms即可供下一批次吸附之
用。膜分離技術(shù)使用0.05—0.1微米的微濾膜將乳鐵蛋白，乳氧化酶蛋白的解
附液除菌，去殘余的脂肪與其它小顆粒；用1K一30K分子截流量的超濾膜進行脫
鹽和濃縮。高純度的乳鐵蛋白是將經(jīng)上述工藝吸附解附脫鹽濃縮的乳鐵蛋白濃
液再經(jīng)過一次弱酸型陽樹脂如CM樹脂的吸附解附和超濾膜的濃縮獲得的。將吸
附、解附、脫鹽濃縮的乳鐵蛋白濃液，乳氧化酶蛋白濃液及其乳鐵蛋白，乳氧 化酶蛋白混合濃液進行真空低溫干燥或低溫噴霧干燥成粉混合物。
釆用攪拌罐而不是裝柱的形式來進行吸咐及解咐的過程。從而不用裝柱及 擔心樹脂柱短路的問題?？梢栽黾訑嚢杷俣纫栽黾游澜飧赖膭恿W速度。在 攪拌罐中增加擋板，從而使蛋白的傳遞速度更快。另夕卜點更重要的是，在罐中 樹脂床表面上安裝-抽濾簡來加快排液速度，于便大工業(yè)生產(chǎn)。 附圖說明
圖l為本發(fā)明的工藝流程簡圖 具體實施方式
1、 采用攪拌罐而不是裝柱的形式來進行吸咐及解咐的過程。從而不用裝柱 及擔心樹脂柱短路的問題?？梢栽黾訑嚢杷俣纫栽黾游澜飧降膭恿W速度。 在攪拌罐中增加擋板，從而使蛋白的傳遞速度更快。另外-點更重要的是，在罐
中樹脂床表面上（圖1中T2罐中的虛線）安裝-抽濾筒（圖1中T2罐中的FT)來加快 排液速度。這是因為當吸咐及解咐結(jié)東時，攪拌漿停止攪拌。樹脂在重力作用 下沉積罐底的過濾板上（圖1中T2罐中的水平粗黑線)形成樹脂床。這時如果樹脂 顆粒太細或太軟就會造成液體難以通過樹脂床，從而造成罐底排液的流量變小， 作業(yè)時間過長，產(chǎn)率下降。為了加快排液速度，在樹脂床表面上安裝-抽濾管， 使大部分的液體不經(jīng)樹脂床而直接經(jīng)抽濾管及閥門V25， V5， VM1及V6排出。當 罐中的液位降到樹脂床表面時，抽濾管FT停止抽液，罐中剩余液體經(jīng)罐底V5， VM1及V6抽出。這樣的過程就大大改善排液的速度。
2、 本法不需對原料牛奶或乳清水調(diào)節(jié)pH及離子強度。而利用牛奶或乳清水 的自然pH及離子強度。其正常pH值應為6. 2-6. 9
3、 本文中指的牛奶是指加熱或未加熱消毒的新鮮奶或不新鮮的牛奶以及用 奶粉配制成的牛奶。
4、 此法可直接釆用全脂牛奶及脫脂牛奶。或者是用奶粉配制成的還原全脂 或脫脂奶。
5、 此法可直接應用乳清水。
6、 陽離子交換樹脂均可作為此法的BLF及BLP的吸,樹脂，但SPC70是為本 法首選吸咐樹脂。
7、 本文釆用的吸咐時間20-UO分鐘，吸咐時間過短，收率過低，吸咁時間 長，可提高收率，但?？紤]過長的加工時間。吸咐及解《#溫度可在3-16度C。8、 采用兩級鹽（氯化鈉）濃度解咁BLP及BLF。第一級鹽濃度為1-2. 5%解咐 BLP,解咐時間為30-IOO分鐘。第二級鹽濃度為3. 5-7。/。解咐BLF,解咐時間為
30-100分鐘。
9、 本法解咐中所用的鹽，可以是鈉鹽如氯化鈉等，可以是鈣鹽如氯化鈣等， 也可以是鉀鹽如氯化鉀等。但本文首選氯化鈉。
10、 本法可連續(xù)生產(chǎn)，即樹脂不需另外再生， 一埃解咐結(jié)東后，用反滲透 水（R0水）洗樹脂至其離子強度低于1.6mS即可開始下一批的吸咁。
11、 攪拌罐中的攪拌速度在30-70rpm。
12、 采用0.05-0.1微米的微濾膜除菌及殘余的脂肪，微小顆粒等
13、 收集的BLP及BLP的洗脫液（解咐液）用1K-30K分子截留量的超濾膜進行
脫鹽及濃縮。
14、 如要生產(chǎn)高純度的BLF,脫鹽并濃縮好BLF再經(jīng)過一次弱酸型的陽樹脂 如CM樹脂的吸咐（圖1中的T7罐）以除去其中少量其它雜蛋白。
15、 濃縮后的BLP及BLF的混合液，BLP溶液及BLF溶液可用冷凍干燥法干燥 (圖1中的FD)也可用噴霧干燥（圖1中的SD)。*后蛋白粉包裝（圖l中的方塊箱）。
16、 超濾膜的濾出鹽水可用反滲透裝置(RO)或電滲折裝置回收鹽水，同時 RO濾出水可作生產(chǎn)用水。
圖1中的T1為奶罐或乳清水罐。原料從T1罐輸送到攪拌罐T2后，攪拌60-120 分鐘。吸咐結(jié)束后，停止攪拌3分鐘讓樹脂自由沉降后，再由抽濾菅FT， VM1， V5, V6將吸咐過的奶液輸送到T3罐。此奶液仍含一定濃度的BLP及BLF，所以仍 可考慮作為牛奶或其它奶制品用。
經(jīng)V3閥門用RO水淋洗樹脂（如是全脂或半脂奶，要用34度C的RO水淋洗）3次 以上，以除去殘余的奶液及脂肪。淋洗液經(jīng)閫門V4排出。
(1) 生產(chǎn)BLP及BLF混合蛋白；
從V2閥門加入5-6yo鹽水后，撹拌60-IOO分鐘后，停止攪拌3分鐘讓樹脂自 然沉降，再經(jīng)FT， V25, V5及VM5將解咁液輸送到TMF罐。
經(jīng)O. l微米的微濾膜將解咐液中的微粒及脂肪除掉。微膜濾液再經(jīng)VM2及V8 輸送到T4罐。再從T4罐經(jīng)V18, V15由超濾膜脫鹽并濃縮到蛋白濃度6。/。以上。其 中V13及V8是超濾膜的回流管路，V7是加水閥門。
BLPF的濃縮液經(jīng)V21輸送到噴霧千燥器干燥或者經(jīng)V20輸送到冷凍干燥器干 燥后得干粉成品。粉未為淡棕綠色。
加RO水經(jīng)V3閥門淋洗在攪拌罐T2己解咐后的樹脂直至離子強度低于1.6毫 西門。淋洗廢液從V4閥門排出。攪拌罐T2現(xiàn)侍命準備下一輪吸咐。
(2) 生產(chǎn)BLP單體及BLF單體；
第一級鹽水解咁BLP;從V2閥門加入1.6-2. 5%鹽水（氯化鈉鹽水），攪拌 40-80分鐘，停止攪拌3分鐘開始抽濾解咁并經(jīng)V25， V5， VM5輸送到TMF罐，然后 再經(jīng)V2用1. 6-2. 5%鹽水淋洗樹脂3次，淋洗液經(jīng)V25， V5, VM5排到TMF罐。
第二級鹽水解咐BLF;從V2閥門向己完成第一級解咐的樹脂加入4-6。/。鹽水 (氯化鈉鹽水），攪拌60-12G分鐘。
在第二級解咐的同時，微濾膜單元也同時對第一級的解咐液進行過濾。濾 液經(jīng)VM2， V10輸送到T5。過濾結(jié)東后，清洗微濾膜單元以準備接受第二級解咐 液。
第二級解咐時間結(jié)東后，將BLF解咐液經(jīng)V25， V5， VM5排入到TMF罐后，由 V3閥加RO水淋洗樹脂3次以上至離子強度為1.6毫西門以下。淋洗液合并到TMF 罐。此時攪拌罐T2巳恢復侍命狀態(tài)淮備下一批生產(chǎn)。
開動微濾單元過濾在TMF罐中的BLF解附液。過濾液經(jīng)VM2， V12輸送到T6罐。
在T5及T6的BLP解咐液及BLF解咁液先后由超濾膜單元脫鹽濃縮。然后BLP 經(jīng)V17輸送到干燥單元。干燥后的粉未為棕綠色。
對要生產(chǎn)高純度的BLF則耍經(jīng)過在T7罐中的陽離子樹脂除去殘余不純的奶 蛋白。BLF的脫鹽溶液經(jīng)V16， V23輸送到T7罐，撹拌吸咐20-50分鐘后，抽濾液 經(jīng)V24輸送到干燥單元進行干燥。干燥后粉未為淡粉紅色。
實施例一：半脫脂牛奶993升，溫度8.2度C, pH6. 6，總蛋白為32. 5克每升， BLP濃度366亳克每升，BLF濃度為138毫升每升。采用圖l的工藝路線，并按說明 所描述的步驟生產(chǎn)BLP與BLF的混合蛋白粉。攪拌罐T2內(nèi)裝SPEC70樹脂。吸咐時 間115分鐘。解咐時加入5.5%氯化鈉鹽水90升，解咐時間65分鐘。解咐及淋洗液 合并到微濾單元（O. l微米微濾膜）進行微濾除菌除脂肪。濾液136升輸送到超濾 膜單元（3QK分子截止量)進行脫鹽濃縮。收得濃縮液Q.52升。釆用冷凍干燥方法 得淡棕綠色干粉351克，含水4. 3%，總蛋白為93. 2%,灰分2. 6%。
實施例二：脫脂牛奶996升，pH6. 7,溫度6. 6度C總蛋白為32. 9克每升，BLP 濃度為378毫克每升，BLF濃度為129毫克每升。采用圖l的工藝路線，并按說明 中所描述的步驟生產(chǎn)單體的BLP蛋白及單體的BLF蛋白。加入內(nèi)裝有SPEC70樹脂 攪拌罐吸咐115分鐘，攪拌速度為60rpm。收集己吸咁過的牛奶后，用RO水淋洗 樹脂。加入第一級鹽水（2.4W90升解咐36分鐘，攪拌速度30rpm。收集第一級BLP 解咐液并加2. 3%鹽水淋洗樹脂3次。合并淋洗液到BLP解咐液中后用微濾膜除菌 及脂肪。
在BLP微濾同時，加入86升4.W鹽水于攪拌罐中進行BLF解咐，攪拌速度 36rpm。解咐時間60分鐘。收集解咐液后用RO水淋洗樹脂。合并淋洗液到解咐液 中共得151升。輸送到微濾單元進行除菌及除脂肪。濾液輸送到超濾單元（30K 分子截止量）并加水進行脫鹽（洗到離子強度低于l. 6毫西門）濃縮至1%蛋白濃度
分子截止量）并加水進行脫鹽（洗到離子強度低于l. 6毫西門）濃縮至1%蛋白濃度
時（7.6升），輸送到CM樹脂罐除去雜蛋白。然后繼續(xù)用超濾膜濃縮到O. 39升后送 至冷凍干燥單元干燥得淡粉紅色粉未80.5克。粉未含水3.1%,灰份1.1%,總蛋 白為96. 5%。
微濾后的BLP輸送超濾單元加水脫鹽（洗到離子強度低于1.6毫西門）后， 繼續(xù)濃縮。收集BLP濃縮液0.73升。用冷凍干燥法干燥得棕綠色粉未351克， 粉未含水4. 2%,灰份2. 1%,總蛋白為94. 1%。